Поскольку вариант Дельта наносит серьезный ущерб невакцинированному населению, а число случаев COVID-19 растет по всему миру, пандемия еще далека от завершения. Несмотря на впечатляюще быстрое развитие диагностических тестов SARS-CoV-2 за последние полтора года, подавляющее большинство образцов пациентов по-прежнему необходимо отправлять в лабораторию для обработки, что замедляет темпы отслеживания случаев COVID-19. Если образец должен быть протестирован на конкретный вариант вируса, он должен быть генетически секвенирован, что требует еще больше времени и ресурсов.
Теперь исследователи из Института биологической инженерии Висса при Гарвардском университете, Массачусетского технологического института (MIT) и нескольких больниц в районе Бостона создали недорогой диагностический тест на основе CRISPR, который позволяет пользователям проверять себя на SARS-CoV. -2 и несколько вариантов вируса с использованием образца их слюны дома без дополнительных инструментов, пишет medicalxpress.com.
Диагностическое устройство, называемое SHERLOCK с минимальным набором инструментов (miSHERLOCK), простое в использовании и обеспечивает результаты, которые можно прочитать и проверить с помощью прилагаемого приложения для смартфона в течение одного часа. Он успешно различает три различных варианта SARS-CoV-2 в экспериментах и может быть быстро перенастроен для обнаружения дополнительных вариантов, таких как Delta. Устройство можно собрать с помощью 3D-принтера и общедоступных компонентов примерно за 15 долларов, а повторное использование оборудования снижает стоимость отдельных анализов до 6 долларов каждый.
«miSHERLOCK устраняет необходимость в транспортировке образцов пациентов в централизованное место тестирования и значительно упрощает этапы подготовки образцов, предоставляя пациентам и врачам более быструю и точную картину здоровья человека и общества, что имеет решающее значение во время развивающейся пандемии», - сказал соавтор. первый автор Хелена де Пуч, доктор философии, научный сотрудник Института Висс и Массачусетского технологического института.
Диагностическое устройство описано в статье, опубликованной сегодня в журнале Science Advances.
От цепочки поставок до SHERLOCK
Будучи инструктором по педиатрии в Бостонской детской больнице со специализацией в области инфекционных заболеваний, соавтор Роуз Ли, доктор медицинских наук, более года работала на переднем крае пандемии COVID-19. Ее опыт работы в клинике послужил источником вдохновения для проекта, который в конечном итоге стал miSHERLOCK.
«Простые вещи, которые раньше были повсеместными в больнице, такие как мазки из носоглотки, внезапно стало трудно достать, поэтому рутинные процедуры обработки образцов были нарушены, что является большой проблемой в условиях пандемии», - сказал Ли, который также является приглашенным научным сотрудником в Институте Висса. «Мотивация нашей команды для этого проекта заключалась в том, чтобы устранить эти узкие места и обеспечить точную диагностику COVID-19 с меньшей зависимостью от глобальных цепочек поставок, а также смогла точно обнаружить варианты, которые начали появляться».
Процедура диагностики требует только, чтобы пользователь плюнул в камеру для подготовки проб, а затем перенес сборный диск в реакционную камеру и нажал на поршень, который активирует реакцию и сводит к минимуму риск перекрестного загрязнения. Предоставлено: Институт Висса при Гарвардском университете.
Для обнаружения SARS-CoV-2 в своей диагностике группа обратилась к технологии на основе CRISPR, созданной в лаборатории члена факультета Wyss Core и старшего автора статьи Джима Коллинза, доктора философии. называется «специфическая высокочувствительная разблокировка ферментативного репортера» (SHERLOCK). SHERLOCK использует «молекулярные ножницы» CRISPR, чтобы вырезать ДНК или РНК в определенных местах, с дополнительным бонусом: этот конкретный тип ножниц также разрезает другие части ДНК в окружающей области, что позволяет создавать молекулы зондов нуклеиновых кислот для генерировать сигнал, указывающий, что цель была успешно поражена.
Исследователи создали реакцию SHERLOCK, предназначенную для разрезания РНК SARS-CoV-2 в определенной области гена, называемого нуклеопротеином, который сохраняется во многих вариантах вируса. Когда молекулярные ножницы - фермент под названием Cas12a - успешно связывается и разрезает ген нуклеопротеина, зонды одноцепочечной ДНК также разрезаются, производя флуоресцентный сигнал. Они также создали дополнительные тесты SHERLOCK, предназначенные для нацеливания на панель вирусных мутаций в последовательностях белка Spike, которые представляют три генетических варианта SARS-CoV-2: альфа, бета и гамма.
Вооружившись тестами, которые могут надежно обнаруживать вирусную РНК в пределах допустимого диапазона концентраций для диагностических тестов, разрешенных FDA, команда затем сосредоточила свои усилия на решении, возможно, самой сложной проблемы в диагностике: приготовлении образцов.
Плевать, ждать, сканировать
«Когда вы тестируете образец на нуклеиновые кислоты <например, ДНК или РНК>, вам необходимо выполнить множество шагов, чтобы подготовить образец, чтобы вы могли действительно извлечь и амплифицировать эти нуклеиновые кислоты. он доставляется в испытательный центр, а также убедитесь, что он не заразен, если вы имеете дело с трансмиссивным заболеванием. Чтобы сделать этот диагностический тест действительно простым в использовании , нам было важно максимально упростить его. насколько это возможно », - сказал соавтор исследования Сяо Тан, доктор медицинских наук, научный сотрудник Института Висс и инструктор по гастроэнтерологии в больнице общего профиля Массачусетса.
В качестве метода сбора данных команда решила использовать слюну, а не мазки из носоглотки, потому что пользователям проще собирать слюну, а исследования показали, что SARS-CoV-2 обнаруживается в слюне в течение большего количества дней после заражения. Но необработанная слюна сама по себе создает проблемы: она содержит ферменты, которые расщепляют различные молекулы, что приводит к высокому уровню ложных срабатываний.
Исследователи разработали новую технику для решения этой проблемы. Во-первых, они добавили в слюну два химиката, называемые DTT и EGTA, и нагрели образец до 95 ° C в течение 3 минут, что устранило ложноположительный сигнал от необработанной слюны и вскрыло все вирусные частицы. Затем они включили пористую мембрану, которая была сконструирована для улавливания РНК на своей поверхности, которую, наконец, можно было добавить непосредственно в реакцию SHERLOCK для получения результата.
Чтобы объединить подготовку образца слюны и реакцию SHERLOCK в одну диагностику, команда разработала простое устройство с батарейным питанием с двумя камерами: камера для подготовки образцов с подогревом и камера для реакции без подогрева. Пользователь плюется в камеру для пробоподготовки, включает нагрев и ждет от трех до шести минут, пока слюна не попадет в фильтр. Пользователь снимает фильтр и переносит его в колонну реакционной камеры, затем толкает поршень, который помещает фильтр в камеру, и прокалывает резервуар для воды, чтобы активировать реакцию ШЕРЛОКА. Спустя 55 минут пользователь смотрит через тонированное окно трансиллюминатора в реакционную камеру и подтверждает наличие флуоресцентного сигнала. Они также могут использовать сопутствующее приложение для смартфонов, которое анализирует пиксели, регистрируемые смартфоном.s камера, чтобы поставить четкий положительный или отрицательный диагноз.
Сопутствующее приложение для смартфона анализирует флуоресцентные данные, полученные в результате анализа, давая пользователям четкий «положительный» или «отрицательный» результат. Результаты также могут быть переданы врачам и организациям здравоохранения для отслеживания распространения болезни. Предоставлено: Институт Висса при Гарвардском университете.
Исследователи протестировали свое диагностическое устройство, используя клинические образцы слюны 27 пациентов с COVID-19 и 21 здорового пациента, и обнаружили, что miSHERLOCK правильно идентифицировал пациентов с COVID-19 в 96% случаев и пациентов без заболевания в 95% случаев. Они также проверили его эффективность в отношении вариантов Alpha, Beta и Gamma SARS-CoV-2, добавив в здоровую человеческую слюну полноразмерную синтетическую вирусную РНК, содержащую мутации, представляющие каждый вариант, и обнаружили, что устройство было эффективным в отношении ряда вирусных РНК. концентрации.
«Одна из замечательных особенностей miSHERLOCK заключается в том, что он полностью модульный. Само устройство отделено от анализов, поэтому вы можете подключать различные анализы для конкретной последовательности РНК или ДНК, которую вы пытаетесь обнаружить», - сказал один из первых. автор Девора Наджар , научный сотрудник MIT Media Lab и Collins Lab. «Устройство стоит около 15 долларов, но массовое производство снизит стоимость корпуса примерно до 3 долларов. Анализы для новых целей могут быть созданы примерно за две недели, что позволит быстро разработать тесты на новые варианты COVID-19 и других заболеваний».
Готовы к реальному миру
Команда miSHERLOCK создала свое устройство с учетом ограниченных ресурсов, поскольку пандемия выявила огромное неравенство в доступе к здравоохранению, которое существует между различными частями мира. Аппаратное обеспечение устройства может создать любой, у кого есть доступ к 3D-принтеру, а файлы и схемы схем общедоступны в Интернете. Добавление приложения для смартфона также было направлено на ограниченные ресурсы, поскольку услуги мобильной связи доступны практически в любой точке мира, даже в районах, до которых трудно добраться пешком. Команда готова работать с производителями, которые заинтересованы в масштабном производстве miSHERLOCK для глобального распространения.
«Когда начался проект miSHERLOCK, мониторинг вариантов SARS-CoV-2 практически не проводился. Мы знали, что отслеживание вариантов будет невероятно важным при оценке долгосрочного воздействия COVID-19 на местные и глобальные сообщества, поэтому мы подтолкнули себя к созданию действительно децентрализованной, гибкой и удобной для пользователя диагностической платформы », - сказал Коллинз, который также является профессором медицинской инженерии и науки в Массачусетском технологическом институте. «Решив проблему подготовки образцов , мы обеспечили, что это устройство практически готово к использованию потребителями как есть, и мы рады работать с промышленными партнерами, чтобы сделать его коммерчески доступным».
«Объединив передовые биотехнологии с недорогими материалами, эта команда создала мощное диагностическое устройство, которое может быть произведено и использовано на местном уровне людьми без высшего медицинского образования. Это прекрасный пример миссии Института Висса в действии: передать изменяющие жизнь инновации в руки людей, которые в них нуждаются », - сказал директор-основатель Wyss Дон Ингбер, доктор медицины, доктор философии, который также является профессором биологии сосудов Гарвардской медицинской школы и Бостонской детской больницы Джуды Фолкмана, и Профессор биоинженерии Гарвардской школы инженерии и прикладных наук Джона А. Полсона.
